前 言
本标准仅对GB 5413—1985中A.3章“半微量凯氏定氮法”的文本格式进行了修改，内容未做改动。
本系列标准从实施之日起，代替GB 5413—1985。
本标准由中国轻工总会提出。
本标准由全国乳品标准化中心归口。
本标准负责起草单位：国家乳制品质量监督检验中心。
本标准参加起草单位：卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢（中国）投资服务有限公司。
本标准主要起草人：王芸、黄敏、李玉贤。
中华人民共和国国家标准
婴幼儿配方食品和乳粉
蛋白质的测定
Milk powder and formula foods for infant and young children
-Determination of protein
GB/T 5413.1—1997
1 范围
本标准规定了蛋白质的测定方法。
本标准适用于婴幼儿配方食品和乳粉中蛋白质的测定。
2 方法提要
在加热时，硫酸分解成亚硫酸酐、水和氧。有机物被氧化为二氧化碳和水，而蛋白质的氨态氮与过量硫酸反应转变为硫酸铵，硫酸铵在碱性溶液中进行蒸馏。将蒸馏出来的氨用硼酸吸收，再用酸标准溶液滴定。
3 试剂
所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。
3．1 浓硫酸。
3．2 硫酸钾。
3．3 硫酸铜。
3．4 过氧化氢溶液：体积分数为30%。
3．5 硼酸溶液：c（HBO）为30 g/L。取30 g硼酸，溶解在1L水中。
3．6 甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：用体积分数为95%的乙醇，将溴甲酚绿及甲基红分别配成1 g/L的乙醇溶液，使用时按1 g/L溴甲酚绿：1 g/L甲基红为5：1的比例混合。
3．7 硫酸标准溶液：c（H+）为0.0500 mol/L。取3 mL浓硫酸加到15 mL水中，冷却后洗入1000 mL容量瓶中，定容。
3．8 氢氧化钠溶液，质量比为400/1000。称取400 g氢氧化钠，用1000 mL水溶解，待冷却后移入试剂瓶中。
4 仪器
常用实验室仪器及：
4．1 凯氏烧瓶：500 mL或250 mL。
4．2 定氮蒸气蒸馏器。
4．3 滴定管：25 mL。
4．4 三角烧瓶：250 mL。
5 操作步骤
5．1 样品的制备
将样品全部移入约两倍于样品体积的洁净干燥容器中，立即盖紧容器，反复旋转振荡，使样品彻底混合均匀。
5．2 测定
5．2．1 称取样品2 g，精确至0.2 mg，放入凯氏烧瓶（4.1）中，加入10 g硫酸钾（3.2）和1 g硫酸铜（3.3），量取200 mL浓硫酸（3.1），徐徐加入凯氏烧瓶中，混合。
注
1 加入样品及试剂时，避免粘附在瓶颈上。
2 加入硫酸钾的作用：提高硫酸的沸点（338℃），增进反应速度。10 g硫酸钾将沸点提高至400℃，但过多的硫酸钾会造成沸点太高，生成的硫酸氢铵在513℃会分解。
3 加入硫酸铜的作用：作催化剂，使氧化作用加速。
5．2．2 凯氏烧瓶的瓶口放一小漏斗，用微火加热（小心瓶内泡沫冲出而影响结果），当瓶内发泡停止，稍加大火力。同时，可分数次加入10 mL过氧化氢溶液（3.4）（但必须将烧瓶冷却数分钟以后加入）。当烧瓶内容物的颜色逐渐转化成透明的淡绿色时，继续消化0.5～1 h（若凯氏烧瓶壁粘有碳化粒时，进行摇动或待瓶中内容物冷却数分钟后，用过氧化氢溶液冲下，继续消化至透明为止）。然后取下并使之冷却。
5．2．3 将澄清的消化液小心移入100 mL容量瓶中，以水洗三次凯氏烧瓶，洗涤液并入上述容量瓶中，冷却后稀释至刻度并摇匀。
5．2．4 吸取25 mL消化液于定氮蒸馏器中，在冷凝器的下端放置一个盛有50 mL硼酸溶液（3.5）、3滴甲基红-溴甲酚绿混合指示剂（3.6）的250 mL锥形瓶，使冷凝器下端的玻璃管在液面以下。将25 mL氢氧化钠溶液慢慢地加入蒸馏瓶中（溶液应呈强碱性），迅速将塞子塞好，然后通入蒸汽进行蒸馏，蒸至液面达150 mL时，提出冷凝器下端的玻璃管，用蒸馏水冲洗冷凝管下端，将洗液一并聚集于硼酸溶液中，让玻璃管靠在锥形瓶的瓶壁，出液口在200 mL刻度线以上，继续蒸馏，蒸至液位达200 mL。
注：蒸馏时要注意蒸馏情况，避免瓶中的液体发泡冲出，进入接受瓶。火力太弱，蒸馏瓶内压力减低，则接受瓶内液体会倒流，造成实验失败。
5．2．5 用硫酸标准溶液（3.7）滴定至溶液出现酒红色为止，记录所用硫酸标准溶液的体积。同时进行空白试验，并在结果中加以校正。
6 分析结果的表述
样品中蛋白质含量（g/100g）= ………（1）
式中：V——滴定时消耗硫酸标准溶液的体积，mL；
V——空白试验消耗硫酸标准溶液的体积，mL；
c（H）——硫酸标准溶液中H的浓度，mol/L；
m——样品的质量，g；
0.014——氮原子的摩尔质量，kg/mol；
F——氮换算为蛋白质的系数。乳粉为6.38，纯谷物类（配方）食品为5.90，含乳婴幼儿谷物（配方）食品为6.25。
注：空白实验仅不加入样品，操作步骤与样品相同。
7 允许差
同一样品的两次测定值之差不得超过平均值的1.5%。